Epigenetic and transcriptomic characterization of Cryptosporidium infection and their implication in digestive neoplasia development
Épigénétiques et génétiques de l’infection par Cryptosporidium et leurs impacts dans le développement des néoplasies digestives
Résumé
Cryptosporidium is an Apicomplexan parasite which infects the gastrointestinal tract of a variety of vertebrates including humans, being diarrhoea the main clinical manifestation. Diarrhoeal illness can be severe or even fatal, especially in immunocompromised hosts. More strikingly, experimental and epidemiological evidences suggest a causal link between Cryptosporidium infection and digestive cancer. Indeed, the development of invasive digestive adenocarcinoma has been reported in an experimental model of dexamethasone treated SCID mice. Even if this parasite was declared as a public health problem by the World Health Organization (WHO) since 2006, its pathogenesis remains poorly understood. For all these reasons it seemed interesting to carry out this thesis project focused on the study of interactions between Cryptosporidium and the host to explore the contribution of the parasite to cancer development. Thus, we decided to articulate the research around two main objectives: 1) To study the role of epigenetics on the interaction between Cryptosporidium and its host, and 2) To investigate signaling pathways involved in C. parvum induced digestive cancer. Firstly, considering that epigenetics has an important role in the transcription regulation, we investigated the histone lysine methylation, as a dynamic epigenetic modification during the complex life cycle of the parasite. Initially, we performed in silico analysis to identify potential histone lysine methyltransferases (HKMTs) of Cryptosporidium. Primary sequence alignment and phylogenetic analysis allowed the identification of putative C. parvum HKMTs and their substrate specificities. By homology modeling we predicted three structurally active HKMTs namely CpSET1, CpSET2 and CpSET8 and their functional significance was justified by observing histone lysine methylations such as H3K4Me3, H3K36Me3 and H4K20Me3 during intracellular development of C. parvum. We cloned and produced the putative HKMT, CpSET8 into a bacterial system, and via an in vitro activity assay we proved the existence of an active HKMT in the parasite. Moreover, host lysine methylation events were also explored and results highlighted the inherit potential of the parasite to exploit the host epigenetic regulation to its advantage. This is the first study to highlight the existence of epigenetic mechanisms regulating Cryptosporidium life cycle and its interaction with the host. Secondly, using the mouse model of cryptosporidiosis successfully developed in the ECOPHIP laboratory, a microarray approach was performed to compare C. parvum infected animals to non-infected controls. Results of this study showed that C. parvum is able to evade the host innate immune response by resisting the upregulated expression of IFNγ-stimulated genes, and downregulating the expression of α-defensins giving rise to chronic inflammation. Systematic inflammation may contribute to the C. parvum-induced immunosuppressive tumor microenvironment (TME) characterized by the presence of cancer associated fibroblasts, myeloid-derived suppressor cells, tumor-associated macrophages and extracellular matrix components. This is the first description of the alteration in the gene expression profile associated to the C. parvum-induced neoplasia. Finally, since the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt signaling pathway was also modulated according to the transcriptomic results, and that PI3K is a signaling kinase implicated in cytoskeletal reorganization, which seems to be pivotal in the process of C. parvum-induced neoplasia, we decided to study in more depth the implication of this pathway. Results of immunohistochemistry and western blot confirmed the activation of this signaling cascade in C. parvum-infected epithelial cells. All these data showed that the mechanisms that contribute to the pathogenicity of the parasite and the induction of digestive neoplasia are clearly multifactorial and involve both parasite and host factors.
Cryptosporidium est un parasite Apicomplexa infectant le tractus gastro-intestinal d'un grand nombre de vertébrés dont l'homme. La diarrhée est la principale manifestation clinique. Elle peut s'avérer grave, voire mortelle chez les individus immunodéprimés. De plus, de nombreuses études expérimentales et épidémiologiques suggèrent qu'il existe un lien de causalité entre l'infection par Cryptosporidium et le cancer digestif. En effet, il a été rapporté que ce parasite pouvait induire le développement d'adénocarcinomes digestifs invasifs chez un modèle expérimental de souris SCID traitées à la dexaméthasone. Bien qu'il ait été considéré depuis 2006, par l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) comme étant un problème de santé publique, sa pathogénie reste mal connue. Pour toutes ces raisons, il nous a semblé intéressant, dans le cadre de ce projet de thèse, d'étudier les interactions entre Cryptosporidium et son hôte afin d'explorer son rôle dans le développement du cancer. Ce travail s'articule donc autour de deux principaux objectifs : 1) Etudier le rôle de l'épigénétique dans les interactions entre Cryptosporidium et son hôte, et 2) Etudier les voies de signalisation impliquées dans le développement du cancer digestif induit par C. parvum. Dans un premier temps, considérant que l'épigénétique joue un rôle important dans la régulation de la transcription, nous avons étudié la méthylation de la lysine des histones, au cours du cycle biologique du parasite. Une première analyse in silico a permis d'identifier les histone lysine méthyltransférases (HKMTs) potentielles de Cryptosporidium. Ensuite, l'alignement des séquences primaires et l'analyse phylogénétique ont permis d'identifier les HKMTs putatives de C. parvum et leurs spécificités de substrat. De plus, nous avons également pu prédire par modélisation, l'existence de trois HKMTs structurellement actives, à savoir CpSET1, CpSET2 et CpSET8. Leur rôle fonctionnel a été justifiée par l'observation de la méthylation de lysine d'histones telles que H3K4Me3, H3K36Me3 et H4K20Me3 pendant le développement intracellulaire de C. parvum. Nous avons réussi via des clonages et des tests d'activité in vitro, à montrer l'existence d'une HKMT CpSET8 active. De plus, les événements de méthylation de la lysine de l'hôte ont également été explorés et les résultats ont mis en évidence le potentiel du parasite à exploiter la régulation épigénétique de l'hôte à son avantage. C'est la première étude mettant en évidence l'existence de mécanismes épigénétiques régulant le cycle biologique de Cryptosporidium. Dans un second temps, nous avons réalisé, toujours sur le même modèle murin, une étude transcriptomique qui a montré que C. parvum est capable d'échapper à la réponse immunitaire innée de l'hôte en résistant à la surexpression des gènes stimulés par l'IFNγ, et en régulant à la baisse l'expression des α-défensines, donnant lieu à une inflammation chronique. Cette inflammation systématique peut donc contribuer au microenvironnement tumoral (TME) immunosuppressif induit par C. parvum. Il s'agit de la première description de l'altération du profil d'expression génétique associé à la néoplasie induite par C. parvum. Enfin, cette étude a également permis de mettre en évidence le fait que la voie de signalisation phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt était également modulée et sachant que PI3K est une kinase de signalisation impliquée dans la réorganisation du cytosquelette lors de l'infection par C. parvum, nous avons décidé d'étudier plus en profondeur l'implication de cette voie dans l'induction du cancer par ce parasite. Les résultats des analyses biochimiques et immunohistochimiques, ont confirmé l'activation de cette cascade de signalisation dans les cellules épithéliales infectées par C. parvum. Toutes ces données plaident en faveur d'une induction multifactorielle des néoplasies digestives par le parasite impliquant des facteurs liés à la fois au parasite et à l'hôte.
Domaines
Parasitologie
Origine : Version validée par le jury (STAR)