Amide bond formation by diverted enzymatic reactions
Formation de liaisons amides par réactions enzymatiques détournées
Résumé
The amide function is widespread in nature and also in many synthetic products such as pharmaceuticals and polymers. Numerous approaches have been developed to provide reliable synthesis methods. The most common approach in conventional chemistry is the acylation of an amine by activated carboxylic acid. Activation requires the use of either coupling reagents resulting in low atom economy, or expensive catalysts sometimes used under drastic conditions. Biocatalytic approaches are therefore interesting alternatives for economic and environmental reasons. Different enzymes can be used such as hydrolases, nitrile hydratases and transglutaminases that activate the acid in acyl-enzyme form to promote the nucleophilic addition of the amine. In recent years, interest in ATP-dependent enzymes has increased.
In this project, we focused on CoA ligases that catalyze the formation of activated acid as acyl-adenylate and then acyl-thioester. We have thus demonstrated that by diverting the reaction by scavenging activated intermediate with an amine, we obtain the amide. The use of thermophilic CoA ligases allows us to work at a high temperature and thus facilitate the uncatalyzed addition of the amine.
This system therefore dispenses with the use of expensive HSCoA. For a better system, we have also successfully integrated an ATP regeneration system with a Polyphosphate Kinase 2 (Class III) and an inorganic pyrophosphatase. The efficiency of this cascade was illustrated by the lab-scale chemo-enzymatic synthesis of N-methylbutyrylamide in 77 % yield using low enzyme loading.
Biodiversity exploration using a genomic approach based on sequence comparison allowed us to identify several thermophilic CoA ligases active towards ω-amino acid substrates. K6Q029 from Thermaerobacter subterraneus was further studied. In particular, this enzyme is active towards ω-amino acid substrates, functionalized or not, with more or less long carbon chains, as well as on various carboxylic acids such as aromatics.
Thanks to the structural resolution of A4YDT1, a promiscuous CoA ligase from the literature, we have identified, in collaboration with a team of crystallographers from the University of Groningen (Netherlands), the residues involved in its substrate specificity to modify them by a rational approach. Variants of this enzyme have thus allowed to obtain δ-valerolactam and Ɛ-caprolactam.
La fonction amide est omniprésente dans les produits naturels et aussi dans de nombreux composés synthétiques comme des principes actifs et des polymères. De nombreuses approches ont été développées pour disposer de méthodes de synthèse efficaces. L’approche la plus courante en chimie conventionnelle est l’acylation d’une amine par un acide carboxylique activé. L’activation nécessite l’utilisation soit d’agents de couplage, résultant en une faible économie d’atomes, soit de catalyseurs couteux parfois utilisés dans des conditions drastiques. Les approches biocatalytiques sont donc des alternatives intéressantes pour des raisons économiques et environnementales. Différentes enzymes peuvent être utilisées comme des hydrolases, des nitrile hydratases et des transglutaminases qui activent l’acide sous forme acyl-enzyme pour favoriser l’addition nucléophile de l’amine. Depuis quelques années, l’intérêt pour les enzymes dépendantes de l’ATP s’est accru.
Dans ce projet, nous nous sommes intéressés aux CoA ligases qui catalysent la formation d’acide activé sous forme d’acyl-adenylate puis acyl-thioester. Nous avons ainsi mis en évidence qu’en détournant la réaction par piégeage de l’intermédiaire activé par une amine, nous obtenons l’amide. L’utilisation de CoA ligases thermophiles permet de travailler à une température élevée et ainsi de faciliter l’addition non catalysée de l’amine. Ce système s’affranchit donc de l’utilisation de HSCoA onéreux. Pour un système efficace, nous avons aussi intégré avec succès un système de régénération de l’ATP comprenant une PPK2-III 2 et une PPase. L’efficacité de cette cascade a été illustrée par la synthèse chemo-enzymatique à l’échelle du laboratoire du N-méthylbutyrylamide avec un rendement de 77 % avec de faibles quantités en enzyme. L’exploration de la biodiversité par approche génomique basée sur la comparaison de séquence, nous a permis d’identifier plusieurs CoA ligases thermophiles actives sur des substrats ω-amino acides précurseurs de lactames. K6Q029 issue de Thermaerobacter subterraneus a fait l’objet d’études plus approfondies. Elle est notamment active sur des substrats ω-amino acides fonctionnalisés ou non, de chaines carbonées plus ou moins longues, mais aussi sur des acides carboxyliques variés tels que des aromatiques. Grâce à la résolution structurale d’A4YDT1, une CoA ligase promiscuitaire, nous avons identifié, en collaboration avec une équipe de cristallographes de l’université de Groningen (Pays Bas), les résidus impliqués dans sa spécificité de substrats pour les modifier par une approche rationnelle. Des mutants de cette enzyme ont ainsi permis l’obtention de δ-valerolactame et Ɛ-caprolactame.