Structural and functional study of the polysaccharidases of Rhodopirellula baltica
Etude structurale et fonctionnelle des polysaccharidases de Rhodopirellula baltica
Résumé
The cell wall of marine algae is characterized by the abundance of anionic polysaccharides (sulfated or uronic) which have no equivalent in land plants. These polysaccharides constitute a crucial carbon resource for numerous heterotrophic marine bacteria, which play a central role in the global carbon cycle in the sea. Among these microorganisms, the planctomycete Rhodopirellula baltica appears as a good model to indentify enzymes specific for algal polysaccharides. Its genome contains numerous carbohydrate active enzymes (29GH, 4PL, 17CE and 59 GT, http://www.cazy.org/) and more than 100 sulfatases! In order to understand the molecular basis of the ecological role of R. baltica, I have started a medium-throughput project. Using various bioinformatics tools, I have established that the 120 polysaccharides from R. baltica are constituted by 165 independent structural modules. I have selected 96 targets, based on their structural and/or functional signifiance, cloned into a His-tag vector. 96/96 targets have been successfully transformed into E. coli strain. Recombinant proteins have been overexpressed at low temperature (20°) in an auto-inducer culture medium. The expression and the solubility of the proteins have been tested by SDS-PAGE and Dot-Blot analyses. At least 30 target-proteins have been expressed under a soluble form. Four enzymes have been expressed on a wider scale, then purified, characterized biochemically and studied by cristallography. I could give evidence that at least two of those enzymes have been incorrectly annoted (two glycoside hydrolases of the families GH16 and GH57), and I confirmed the pectase lyase activity on one of them (family PL1), on which cristallographic study have been done. I've also performed some bioinformatic analyses of all the polysaccharide-related enzymes of R. baltica in order to reevaluate the initial annotations of these enzymes, and to sharpen our understanding of the ecological role of this bacterium. These analyses lead me to reconstruct some of the main metabolisms implying polymers degradation. In correlation with my experimental data, I could settle the grounds for wider experiments in the study of those metabolisms.
La paroi des algues marines est caractérisée par une forte abondance de polysaccharides anioniques (sulfatés ou uroniques) qui n'ont pas d'équivalents chez les plantes terrestres. Ils constituent une source de carbone cruciale pour de nombreuses bactéries marines hétérotrophes qui jouent un rôle central dans le cycle global du carbone dans les océans. Parmi ces microorganismes, la planctomycète Rhodopirellula baltica apparaît comme un bon modèle pour identifier les enzymes spécifiques de ces polysaccharides algaux. Son génome contient de nombreuses polysaccharides (29GH, 4PL, 17CE et 59 GT, http://www.cazy.org/) ainsi que plus de 100 sulfatases ! Dans le but de comprendre les bases moléculaires du rôle écologique de R. baltica, j'ai procédé à une étude à moyen-débit des polysaccharides de cette bactérie. Aidés de divers outils bioinformatiques, j'ai établi que les 120 polysaccharides de R. baltica sont constitués de 165 modules structuralement indépendants. J'ai sélectionné 96 cibles parmi ces modules, en fonction de leur intérêt structural et/ou fonctionnel, et les ait inséré dans un vecteur avec une étiquette poly-His. 92/96 gènes ont été clonés avec succès dans une souche E. coli. La surexpression des protéines recombinantes a été réalisée à basse température (20°) dans un milieu de culture auto-inducteur. Leur expression et solubilité ont été testées par des analyses en SDS-PAGE et Dot-Blot. Au moins 30 protéines-cibles ont été exprimées sous forme soluble. Quatre polysaccharides ont été surexprimées en plus grand volume, purifiées, caractérisées biochimiquement et cristallographiquement. J'ai pu mettre en évidence qu'au moins deux de ces enzymes avaient été annotées incorrectement (deux glycoside hydrolases des familles GH16 et GH57), et j'ai confirmé l'activité pectase lyase de l'une d'entre elles (famille PL1), dont plusieurs jeux de données ont été collectés. Parallèlement, j'ai réalisé une étude bioinformatique de l'ensemble des polysaccharides de R. baltica pour réévaluer les annotations initiales de ces enzymes et affiner le rôle de dégradeur mobile que constitue cette bactérie. Cette analyse a permis de reconstruire les grandes voies métaboliques impliquant des polysaccharides complexes et, conjointement avec mes analyses expérimentales, de préparer le terrain à des analyses plus poussées de caractérisation de ces voies métaboliques.
