Barcoding and Biomonitoring : Assesment of stream water quality using benthic diatom metabarcoding
Barcoding et bioindication : développement du metabarcoding des diatomées pour l'évaluation de la qualité des cours d'eau
Résumé
Diatoms are microscopic unicellular algae which are excellent indicators of the ecological status of the environment in which they live. In the Water Framework Directive (WFD), diatom communities are used to assess the quality of rivers. For this purpose, quality indices based on the susceptibility of species to pollution are calculated from the composition and relative abundance of diatom taxa. Species identification is typically carried out under a microscope, which, in addition to being complex, can be time-consuming and costly when many samples are processed.
A newly developed method allows species to be identified, not on the basis of their morphological variability, but on the basis of their genetic variability using short DNA sequences (or DNA barcodes). Combined with high-throughput sequencing technologies, this molecular approach, called metabarcoding, allows to identify all the species present in an environmental sample and to process several hundred samples in parallel. These advantages make metabarcoding an alternative method to those based on morphological identification, which is interesting for the WFD. Although several studies have demonstrated the ability of this approach to correctly identify diatom species found in environmental samples, the lack of reliability in the quantification of the species relative abundances limits the reliability of calculated quality indices and the use of metabarcoding as a tool for biomonitoring. The objectives of this thesis were (i) to identify and optimize the biases impacting the relative quantification of diatoms in metabarcoding; (ii) to apply the molecular approach at a larger scale on environmental samples from river networks in order to compare quality assessments obtained by morphological and molecular approaches.
First, we quantified the bias associated with DNA extraction using pure diatom cultures and environmental samples. Although the choice of the extraction method affects the quality and the quantity of extracted DNA, as the relative abundances of some species identified with metabarcoding, the community composition and water quality index values are not significantly affected. Thus, we decided to use the GenElute method for other works realized during the thesis, as this method produces the largest quantities of DNA at a lower cost. In a second step, using qPCR experiments carried out on pure diatom cultures, we showed that the rbcL gene copy number (used as DNA barcode) is correlated to the cell biovolume, which results in an overestimation of large biovolume species with the metabarcoding. On the basis of this correlation, a correction factor was proposed and applied to metabarcoding data obtained from artificial diatom communities and environmental samples, allowing to obtain species relative abundances similar to those obtained with the morphological approach and to improve the reliability of water quality index values. Finally, the application of the molecular approach at the scale of the WFD rivers monitoring networks of Mayotte and France has enabled us to show that metabarcoding is a faster and cheaper alternative to the morphological approach, while allowing a good water quality assessment of streams.
Our work confirms that the molecular approach can be used to assess the quality of rivers. However, further studies will have to be performed before considering a routine application and its implementation in the WFD, particularly in terms of standardization of the methods used in the molecular approach.
Les diatomées sont des algues unicellulaires microscopiques qui sont d’excellents indicateurs de l’état écologique du milieu dans lequel elles se trouvent. Dans le cadre de la Directive Cadre sur l’Eau (DCE), les communautés de diatomées sont utilisées pour évaluer la qualité des cours d’eau. Pour cela, des indices de qualité basés sur la sensibilité des espèces à la pollution sont calculés à partir de la composition et de l’abondance relative des taxa de diatomées. L’identification des espèces est généralement réalisée au microscope, ce qui, en plus d’être complexe, peut être assez long et coûteux lorsqu’il s’agit de traiter de nombreux échantillons.
Une nouvelle méthode développée récemment permet d’identifier les espèces, non plus sur la base de leur variabilité morphologique, mais sur la base de leur variabilité génétique en utilisant de courtes séquences ADN (ou barcodes ADN). Combinée aux technologies de séquençage à haut débit, cette approche moléculaire, appelée metabarcoding, permet d’identifier l’ensemble des espèces présentes au sein d’un échantillon environnemental et de traiter plusieurs centaines d’échantillons en parallèle. Ces avantages font du metabarcoding une alternative à la méthode d’identification morphologique, intéressante dans le cadre de la DCE. Bien que plusieurs études aient montré la capacité de cette approche à identifier correctement les espèces de diatomées retrouvées dans des échantillons environnementaux, le manque de fiabilité dans la quantification des abondances relatives des espèces limite le calcul d’indices fiable et l’utilisation du metabarcoding comme outil pour la bioindication. Les objectifs de ce travail de thèse ont donc été (i) d’identifier et d’optimiser les biais impactant la quantification relative des diatomées en metabarcoding ; (ii) d’appliquer l’approche moléculaire à large échelle, sur des échantillons environnementaux de réseaux de cours d’eau afin de comparer les évaluations de qualité obtenues par les approches morphologique et moléculaire.
Dans un premier temps, nous avons évalué les biais de quantification liés à l’extraction de l’ADN sur des cultures pures de diatomées et des échantillons environnementaux. Bien que le choix de la méthode d’extraction affecte la qualité et la quantité des ADN extraits, ainsi que les abondances relatives de certaines espèces obtenues en metabarcoding, la composition de la communauté ainsi que les notes de qualités ne sont pas significativement affectées. Nous avons donc décidé d’utiliser pour la suite des travaux la méthode GenElute qui produit les plus grandes quantités d’ADN pour un moindre coût. Dans un deuxième temps, grâce à des expériences de qPCR réalisées sur des cultures pures de diatomées, nous avons montré que le nombre de copies du gène rbcL (utilisé comme barcode ADN) est proportionnel au biovolume des cellules, ce qui a pour conséquence une surestimation des espèces à gros biovolumes en metabarcoding. A partir de cette corrélation, un facteur de correction a été proposé et appliqué sur les données de metabarcoding issues de communautés artificielles et d’échantillons environnementaux, permettant d’obtenir des abondances relatives d’espèces comparables à celles obtenues en microscopie et d’améliorer la fiabilité des notes de qualité. Finalement, l’application de l’approche moléculaire à l’échelle des réseaux DCE de surveillance des cours d’eau de Mayotte et de France métropolitaine a permis de montrer que le metabarcoding est une alternative plus rapide et plus économique que l’approche morphologique, tout en permettant une bonne évaluation de la qualité des cours d’eau.
Nos travaux confirment que l’approche moléculaire peut être utilisée pour évaluer la qualité des cours d’eau. Cependant d’autres études devront être réalisées avant d’envisager une application en routine et une implémentation dans la DCE, notamment en termes de standardisation et de normalisation des méthodes utilisées dans l’approche moléculaire.
Domaines
Biodiversité et Ecologie
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)