Optimization of the detection of Shiga-Toxin producing Escherichia coli (STEC)
Optimisation de la recherche des Escherichia coli producteurs de Shiga-toxines (STEC)
Résumé
The Shiga toxin producing E. coli (STEC) are an emerging cause of food-borne illness and have become a public health priority. Paradoxically, there is no European microbiological criteria for detecting STEC in foodstuffs.
The aim of our study is to investigate the current main protocols used for detecting STEC, in order to suggest new optimized protocols to the manufacturers, which could limit the risk of distributing contaminated foodstuffs. Thus, growth follow-up and modeling of the simultaneous growth of several STEC strains and the background microflora of different matrices were carried out in various enrichment conditions.
The present study shows that when the level of STEC contamination is low, a short enrichment step (e.g. 6 hours for the IMS protocol (ISO EN 16654)) is not sufficient to detect STEC and could lead to false-negative results. However in particular conditions, it is not useful to extend the duration of the enrichment step because a simple competition between the STEC and the background microflora stops the STEC growth. The STEC growth duration depends on the matrix analysed and on its density in background flora. The growth duration varies between 4 and 7h for bovine faecal samples, and from 10 and 12h for ground beef samples in our experiments. For milk samples, another kind of interaction stops the STEC growth before that of the background flora (from 8,5 to 11h in our experiments).
Selective ingredients are often added to enrichment broths in order to improve the growth of STEC by limiting the growth of background microflora. The use of bile salts in enrichment broths has a positive impact for detecting STEC from bovine faecal and milk samples, but has little effect for detecting STEC from ground beef. However, the addition of novobiocin into enrichment broths inhibits the growth of some non-O157:H7 STEC strains, and slows down the growth of some E. coli O157:H7 strains. In order to avoid false-negative results, we strongly suggest that novobiocin should not be systematically added into enrichment broths for detecting STEC from food.
Finally, an optimisation of the current French testing protocol is proposed to detect E. coli O157:H7 in ground beef [ISO 16140] with a higher sample size and a reduced testing duration, while maintaining accuracy and taking into account the industry work flow and its economic constraints.
The aim of our study is to investigate the current main protocols used for detecting STEC, in order to suggest new optimized protocols to the manufacturers, which could limit the risk of distributing contaminated foodstuffs. Thus, growth follow-up and modeling of the simultaneous growth of several STEC strains and the background microflora of different matrices were carried out in various enrichment conditions.
The present study shows that when the level of STEC contamination is low, a short enrichment step (e.g. 6 hours for the IMS protocol (ISO EN 16654)) is not sufficient to detect STEC and could lead to false-negative results. However in particular conditions, it is not useful to extend the duration of the enrichment step because a simple competition between the STEC and the background microflora stops the STEC growth. The STEC growth duration depends on the matrix analysed and on its density in background flora. The growth duration varies between 4 and 7h for bovine faecal samples, and from 10 and 12h for ground beef samples in our experiments. For milk samples, another kind of interaction stops the STEC growth before that of the background flora (from 8,5 to 11h in our experiments).
Selective ingredients are often added to enrichment broths in order to improve the growth of STEC by limiting the growth of background microflora. The use of bile salts in enrichment broths has a positive impact for detecting STEC from bovine faecal and milk samples, but has little effect for detecting STEC from ground beef. However, the addition of novobiocin into enrichment broths inhibits the growth of some non-O157:H7 STEC strains, and slows down the growth of some E. coli O157:H7 strains. In order to avoid false-negative results, we strongly suggest that novobiocin should not be systematically added into enrichment broths for detecting STEC from food.
Finally, an optimisation of the current French testing protocol is proposed to detect E. coli O157:H7 in ground beef [ISO 16140] with a higher sample size and a reduced testing duration, while maintaining accuracy and taking into account the industry work flow and its economic constraints.
A l'heure actuelle, les Escherichia coli producteurs de Shiga-toxines (STEC) sont considérés comme des pathogènes émergents importants en santé publique. Cependant, il n'existe aujourd'hui aucune réglementation officielle stipulant les procédures à suivre pour l'échantillonnage et la recherche des STEC dans les denrées alimentaires.
Ce travail a pour objectif d'étudier les différents protocoles utilisés pour la recherche des STEC, de manière à pouvoir proposer aux industriels des protocoles optimisés leur permettant une réelle maîtrise du « danger STEC » dans leur filière. Dans ce but, la cinétique de croissance de diverses souches de STEC a, dans différentes conditions d'enrichissement, été suivie simultanément à celle de la flore annexe de la matrice, puis modélisée.
Notre étude souligne qu'un enrichissement trop court, comme les 6 heures d'incubation dans le cas de l'IMS, peut conduire à l'obtention de résultats faussement négatifs. Il s'avère néanmoins inutile, dans certaines conditions, de prolonger l'étape d'enrichissement car une interaction de type compétition simple avec la flore annexe arrête la croissance des STEC. Cet arrêt est plus ou moins rapide selon la matrice analysée et sa densité en flore annexe naturelle (de 4 à 7 h pour les fèces et de 10 à 12 h pour le steak haché dans nos expérimentations). Dans le lait, des interactions plus complexes entraînent un arrêt de la croissance des STEC avant celui de la flore naturelle (8,5 à 11 h dans nos expérimentations).
L'utilisation d'agents sélectifs a pour but de freiner la croissance de la flore annexe, ce qui peut avoir pour impact de prolonger la croissance des STEC. L'ajout de sels biliaires dans le milieu d'enrichissement a un effet positif dans le cas de l'enrichissement d'échantillons de fèces de bovins et de lait cru mais n'a pas d'effet significatif pour la matrice « steak haché ». En revanche, l'addition de novobiocine dans le milieu peut inhiber certaines souches de STEC non-O157:H7 et ralentir la croissance de E. coli O157:H7. L'usage de cet antibiotique, potentiellement responsable de résultats faussement négatifs, devrait être abandonné.
Par ailleurs, cette étude a permis d'optimiser le protocole de recherche de E. coli O157:H7 dans le steak haché (ISO 16140) en validant, d'une part, l'analyse d'une plus grosse masse d'échantillon dans un même volume de milieu (ratio plus élevé) et en réduisant, d'autre part, le temps d'analyse grâce à l'utilisation d'une température d'incubation plus élevée de 41,5°C.
Ce travail a pour objectif d'étudier les différents protocoles utilisés pour la recherche des STEC, de manière à pouvoir proposer aux industriels des protocoles optimisés leur permettant une réelle maîtrise du « danger STEC » dans leur filière. Dans ce but, la cinétique de croissance de diverses souches de STEC a, dans différentes conditions d'enrichissement, été suivie simultanément à celle de la flore annexe de la matrice, puis modélisée.
Notre étude souligne qu'un enrichissement trop court, comme les 6 heures d'incubation dans le cas de l'IMS, peut conduire à l'obtention de résultats faussement négatifs. Il s'avère néanmoins inutile, dans certaines conditions, de prolonger l'étape d'enrichissement car une interaction de type compétition simple avec la flore annexe arrête la croissance des STEC. Cet arrêt est plus ou moins rapide selon la matrice analysée et sa densité en flore annexe naturelle (de 4 à 7 h pour les fèces et de 10 à 12 h pour le steak haché dans nos expérimentations). Dans le lait, des interactions plus complexes entraînent un arrêt de la croissance des STEC avant celui de la flore naturelle (8,5 à 11 h dans nos expérimentations).
L'utilisation d'agents sélectifs a pour but de freiner la croissance de la flore annexe, ce qui peut avoir pour impact de prolonger la croissance des STEC. L'ajout de sels biliaires dans le milieu d'enrichissement a un effet positif dans le cas de l'enrichissement d'échantillons de fèces de bovins et de lait cru mais n'a pas d'effet significatif pour la matrice « steak haché ». En revanche, l'addition de novobiocine dans le milieu peut inhiber certaines souches de STEC non-O157:H7 et ralentir la croissance de E. coli O157:H7. L'usage de cet antibiotique, potentiellement responsable de résultats faussement négatifs, devrait être abandonné.
Par ailleurs, cette étude a permis d'optimiser le protocole de recherche de E. coli O157:H7 dans le steak haché (ISO 16140) en validant, d'une part, l'analyse d'une plus grosse masse d'échantillon dans un même volume de milieu (ratio plus élevé) et en réduisant, d'autre part, le temps d'analyse grâce à l'utilisation d'une température d'incubation plus élevée de 41,5°C.