Potentiel de la chromatographie liquide haute performance dénaturante (D-HPLC) en écologie bactérienne des produits laitiers
Résumé
La Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (D-HPLC) est une technique de chromatographie de paires d’ions en phase inverse. Elle associe les principes des méthodes HPLC et des méthodes de séparation de molécules d’ADN en conditions dénaturantes (i.e. TTGE/DGGE) grâce à des colonnes spécifiques qui éluent les molécules d’ADN double brin en fonction de leur température de 1/2 dénaturation (Tm). Polyvalente, elle sépare les fragments d’ADN selon leur taille et leur séquence en condition dénaturante et au nucléotide près en condition non dénaturante.
Depuis les années 1990, la D-HPLC est largement utilisée dans le domaine médical, dans le but de détecter des mutations chromosomiques. Plus récemment, quelques applications ont vu le jour dans le domaine de l’écologie microbienne.
Nous avons testé le potentiel de la D-HPLC (Système WAVE, Transgenomic Ltd) dans le domaine de l’écologie microbienne des produits laitiers, pour : i) analyser la biodiversité bactérienne dans les produits laitiers, ii) diagnostiquer des laits de mammites (infectés), iii) suivre la dynamique des populations bactériennes du lait au fromage affiné ; iv) identifier et séparer des souches pures (bactéries lactiques, staphylocoques).
Les essais mettent en avant différents avantages de la D-HPLC Par exemple, nous avons observé une meilleure différentiation des espèces de staphylocoques comparée à celle obtenue sur gels en conditions dénaturantes (TTGE). Les fragments d’ADN peuvent être marqués et détectés en fluorescence améliorant la sensibilité de la technique. Le collecteur automatique permet la récupération des fragments d’ADN élués en vue de leur séquençage ce qui est nettement moins fastidieux que le découpage des bandes sur les gels de polyacrylamide.
En conclusion, cette technique entièrement automatisée offre des perspectives très prometteuses en écologie microbienne des produits alimentaires en complétant le répertoire actuel des méthodes d’analyse des écosystèmes complexes.
Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)