Deciphering of flavescence dorée phytoplasma adhesion to cells of its insect vector
Décryptage de l’adhésion du phytoplasme de la flavescence dorée aux cellules de son insecte vecteur
Résumé
Flavescence dorée is an epidemic grapevine disease associated with a phytoplasma infection and affecting viticultural areas throughout Southern Europe. The phytoplasma is transmitted among Vitis by its leafhopper vector Scaphoideus titanus. A better understanding of the interaction between the phytoplasma and its vector could help in the development of new strategies to reduce disease spread in the vineyard. The flavescence dorée phytoplasma (FDp) adhesion to the midgut epithelium cells of its insect vector is partly mediated by the Variable Membrane Protein A (VmpA), an adhesin which shows lectin properties. Morevover, VmpA sequence variation is correlated to the vector competence towards different phytoplasmas genotypes. The aim of this work was to identify proteins of the FDp experimental vector E. variegatus interacting with VmpA.For that purpose, we identified E. variegatus cells proteins interacting with recombinant VmpA-His6 by mass spectrometry analysis of VmpA-E. variegatus protein complexes formed upon in vitro interaction assays. Thirteen candidate proteins possessing potential N-glycosylation sites and predicted transmembrane domains were selected. To assess their impact in VmpA binding, we reduced the expression of the candidate genes on E. variegatus cells in culture by dsRNA-mediated RNAi. We optimised RNAi protocol to simultaneously inhibit twelve genes in E. variegatus cultured cells with a satisfying efficiency. The effect of candidate gene knockdown on VmpA binding was measured by the capacity of VmpA-coated fluorescent beads to bind E. variegatus cells. The decrease in the expression of an unknown transmembrane protein with Leucine Rich Repeat domains (uk1_LRR) was correlated with the decreased adhesion of VmpA-beads to E. variegatus cells. Uk1_LRR expression levels evaluated in infected insects throughout the infection slightly increased following ingestion of phytoplasmas meanwhile it was stable in non-infected insects. Moreover, the uk1_LRR was more expressed in digestive tubes than in salivary glands of E. variegatus, suggesting the possible implication of this protein in early stages of the infection by the phytoplasma.A double yeast hybrid assay was set up in order to explore the potential protein-protein interactions occurring between VmpA and E. variegatus through heterologous expression in yeast cells. No interaction was evidenced through this technique.In conclusion, our results suggest the implication of E. variegatus uk1_LRR in VmpA mediated adhesion of the phytoplasma to its insect vector cells. The role of uk1_LRR as VmpA receptor still need to be confirmed, as well as its implication in phytoplasma transmission and vector specificity.
La flavescence dorée (FD) est une maladie de la vigne provoquée par un phytoplasme transmis par la cicadelle Scaphoideus titanus. Elle affecte désormais de nombreuses régions viticoles en Europe du sud. Mieux comprendre l’interaction phytoplasme-insecte vecteur pourrait aider au développement de techniques innovantes pour contrôler les épidémies de FD. Le mécanisme de colonisation des tissus de l’insecte vecteur par le phytoplasme n’a pas encore été décrypté mais il a été démontré que la protéine de surface VmpA du phytoplasme FD est une adhésine qui intervient dans les étapes précoces d'adhésion aux cellules du vecteur. La protéine VmpA interagit avec les résidus N-acetyl-glucosamine et mannose portés par les glycoprotéines membranaires de l’insecte vecteur et ses variations de séquence sont corrélés à la capacité de vection par S. titanus. Dans ce contexte, l’objectif de mon projet de thèse était d’identifier les protéines d’insecte interagissant avec la VmpA.Les protéines des cellules en culture de l’insecte vecteur Euscelidius variegatus (cellules Euva) interagissant in vitro avec la protéine recombinant VmpA-His6 ont été identifiées par spectrométrie de masse. Treize protéines candidates ont été selectionnées en raison de leur proprietés d’interaction avec la VmpA, de la présence dans leur séquence de sites potentiels de N-glycosylation et de segments transmembranaires compatibles avec leur localisation à la surface des cellules. L’étape de validation de l’interaction avec la VmpA a consisté à mesurer l’effet de la baisse de l’expression de ces gènes provoquée par ARN interférence (RNAi) sur l’adhésion de billes fluorescentes recouvertes de VmpA aux cellules Euva. Cette technique de RNAi a été utilisée pour inhiber simultanément l’expression de douze gènes, tout en gardant un niveau d’inhibition comparable à celui obtenu dans le cadre de l’inhibition d’un seul gène. Lorsque l’expression de la protéine uk1_LRR était inhibée, les billes recouvertes de VmpA adhéraient significativement moins aux cellules Euva.Cette protéine uk1_LRR est constituée de 4 domaines LRR (Leucine Rich Repeat) et les prédictions structurales indiquent qu'elle forme une structure en fer à cheval typique de protéines impliquées dans des interactions protéine-protéine. L’expression de uk1_LRR a été mesurée par PCR en temps réel chez des insectes E. variegatus infectés ou non-infectés par le phytoplasme FD. L’expression de uk1_LRR est restait stable chez les insectes non infectés et chez les insectes infectés une augmentation de son expression a été constatée 7 jours après le début de l’acquisition de phytoplasmes ainsi qu’à 28 jours, probablement suite à une re-ingestion de novo du phytoplasme transmis à la fève durant la latence. Des insectes sains ont été disséqués pour évaluer l’expression de la protéine uk1_LRR dans differents organs par PCR en temps réel: le gène uk1_LRR était 6 fois plus exprimé dans les intestins par rapport aux glandes salivaires et 18 fois plus par rapport aux ovaires. Ces résultats sont compatibles avec une possible implication de la protéine uk1_LRR dans les étapes précoces de l’interaction entre le phytoplasme FD et son insecte vecteur, notamment, dans les phases suivant l’ingestion de la sève infectée.La technique du double hybride chez la levure Saccharomyces cerevisiae a été utilisée pour visualiser d’éventuelles interactions entre la VmpA et l’ensemble des protéines de l’insecte vecteur E. variegatus. Aucun résultat positif d’interaction n’a été obtenu.En conclusion, les travaux effectués dans le cadre de ma thèse ont amené à l’identification d’une protéine contenant des domaines LRR impliquée dans l’adhésion de la VmpA du phytoplasme de la flavescence dorée aux cellules en culture de l’insecte vecteur E. variegatus. Le rôle de cette protéine dans la transmission du phytoplasme aux plantes et dans la spécificité de vection reste à confirmer.
Origine : Version validée par le jury (STAR)