Selenium labeling associated with elemental mass spectrometry for receptor-ligand interactions measurement
Mesure d'interaction récepteur-ligand par marquage au sélénium et détection en spectrométrie de masse élémentaire
Résumé
Measuring interactions between a drug candidate and its specific target constitutes a parameter of upmost importance in drug discovery process. Because of its robustness and very high sensitivity, radio-isotopic labeling represents up to now the reference method for these pharmacological studies. However, the use of radioactivity confers several constraints about security, health hazards and environmental issues involved by radioactive waste storage. Regarding such limitations, non-radioactive technologies have been developed principally based on fluorescence detection. But the cost of such assay as well as the fact that incorporation of a bulky fluorescent block can affect the affinity for small ligand limit their use. In this context, we aim to develop a new methodology to quantify receptor-ligands interactions. Mass spectrometry (MS) presents very interesting features in terms of detection sensitivity and specificity, making this technique a challenging analytical tool to replace radioactivity and fluorescence measurements commonly used in pharmacology. Among all MS technologies, the capacity of inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) to provide metallic and hetero elements absolute quantification, whatever the nature of the sample medium, prompted us to investigate this technique in combination with an appropriate labeling of the molecule of interest. Selenium was selected as a good compromise between ICP-MS response and chemical tagging ability through the creation of covalent bonds using conventional organic sulfur chemistry without disturbance of the affinity toward targeted receptor. Proof of concept was illustrated on the vasopressin receptor (V1A), a GPCR involved in vasoconstriction and emotional behavior and implying peptide as native ligand. Different strategies were applied to design selenium labeled peptides relying in either conventional amino acid substitution by corresponding selenium containing residue into peptide sequence such as cysteine (Cys) replacement by selenocysteine (Sec) as well as proline (Pro) by selenazolidine (Sez), or N-terminal peptide derivatization with a selenium containing small organic entity. ICP-MS analytical methodology was carefully investigated to provide sensitive and reliable selenium signal measurement. High inorganic salts contents of pharmacological buffer along with polyatomic interferences from plasma interfering selenium detection necessitate chromatographic separation and collision reaction cell equipment before ICP-MS detection. The pharmacological protocol was also adapted to the analytical requirements, in particular quantity of cells and sample handling. Robustness of the designed competitive binding assay was evaluated through the affinity constant (Ki) measurement of several known V1A-R ligands exhibiting either high or poor affinity for the receptor. Experimental values were strongly correlated to literature data, enabling to validate the proof of concept of such methodology and to propose a suitable alternative to radioactive labeling.
La mesure d’interaction entre une molécule candidate et sa cible biologique est d’un intérêt majeur dans la recherche de nouveaux composés thérapeutiques. A l’heure actuelle, le marquage radioactif est la méthode de référence pour ce type d’étude pharmacologique, permettant une détection spécifique et extrêmement sensible de la molécule d’intérêt dans des matrices biologiques complexes. Cependant l’utilisation de la radioactivité présente de nombreux inconvénients, principalement en termes de sécurité pour les utilisateurs et problématiques environnementales induites par le stockage de déchets radioactifs. Au regard de ces limitations, des technologies alternatives ont été développées principalement basées sur une détection de fluorescence. Toutefois, l’incorporation de groupements encombrants tels que les fluorophores peut potentiellement perturber les propriétés physico-chimiques de la molécule et ainsi altérer son affinité envers le récepteur, ce qui limite l’application de ce type de stratégie pour les ligands de faible poids moléculaire. Dans ce contexte, nous souhaitons développer une méthodologie alternative pour quantifier les interactions récepteur-ligands. La spectrométrie de masse présente de remarquables capacités en termes de sensibilité et de spécificité d’analyse. Parmi les technologies existantes, l’ICP-MS est une technique extrêmement sensible permettant la quantification absolue d’hétéroéléments indépendamment de la matrice dans laquelle se trouve l’échantillon. Cette technique associée à un marquage approprié de la molécule d’intérêt a donc été évaluée. Le sélénium a été sélectionné comme un bon compromis entre la réponse obtenue en ICP-MS et la possibilité d’introduire ce marqueur au sein de la molécule d’intérêt selon des protocoles de chimie conventionnelle, sans perturbation de l’affinité pour le récepteur. La preuve de concept a été illustrée sur le récepteur à la vasopressine V1A impliquant des ligands de nature peptidique. Différentes stratégies ont été appliquées pour la conception de ligands marqués au sélénium basées sur la substitution d’acides aminés par leurs analogues séléniés (ex : remplacement de la cystéine (Cys) par la sélénocystéine (Sec) et de la proline (Pro) par la sélénazolidine (Sez)) ainsi que la dérivatisation en position N-terminale du peptide avec une petite molécule organique. La méthodologie analytique par ICP-MS a été développée de manière à obtenir une mesure du sélénium à la fois sensible et fiable. La forte proportion de sels inorganiques contenus dans la matrice pharmacologique a nécessité le recours à une séparation chromatographique et à une cellule de collision en amont de la détection par ICP-MS. Le protocole pharmacologique a également été adapté aux exigences analytiques. Ces modifications ont notamment porté sur la récupération de l’échantillon pour procéder à son injection ainsi que sur la quantité de cellules utilisées. La robustesse des expériences pharmacologiques ainsi conçues a été évaluée par la mesure de la constante d’affinité (Ki) de ligands caractéristiques du récepteur V1A présentant des affinités élevées et faibles pour ce dernier. Les résultats obtenus ont présenté une très bonne corrélation avec les valeurs de référence indiquées dans la littérature, permettant ainsi de valider la preuve de concept de cette méthodologie et de proposer une alternative viable au marquage radioactif.
Origine : Version validée par le jury (STAR)
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