A rapid HPLC method for the extraction and quantification of vitamin B12 in dairy products and cultures of Propionibacterium freudenreichii
Une méthode HPLC rapide pour extraire et quantifier la vitamine B12 dans les produits laitiers et les cultures de Propionibacterium freudenreichii
Résumé
To overcome nutritional vitamin B12 deficiencies in certain populations in Southern Africa, fortified functional foods have been developed. However, current microbiological methods used to accurately determine vitamin B12 levels in foodstuffs, important for quality control and regulatory purposes, are time consuming. This study describes an extraction and detection method for vitamin B12 in dairy products and growth media cultured with Propionibacterium freudenreichii. Samples were extracted by mixing in KCN buffer (pH 4.5), autoclaving at 121 °C for 25 min, cooling and centrifugation. The resultant supernatant was syringe-filtered prior to reversed-phase HPLC analysis using a methanol-water gradient that was effective in resolving the B12 peak. The method offered excellent linearity with a regression coefficient R > 0.998. The limit of quantification was 0.005 μg*mL−1 sample. For samples with vitamin B12 concentrations well within the linear range of the assay, good repeatability was demonstrated for the same sample with mean concentrations of 2.62 ± 0.02 and 2.61 ± 0.02 μg*mL−1 detected on day 1 and day 2, respectively. Recovery values ranged from 98.6% to 103.2%, indicating that the extraction method ensured complete dissolution of vitamin B12 from the matrices under study. Sensitivity was enhanced by sample concentration and purification using a series of solid phase extraction steps which resulted in improved peak resolution and removal of interfering peaks. The method was validated by comparison of the HPLC results of the same sample with those obtained using traditional microbiological methods. The method is a rapid alternative to the more time-consuming microbiological assay.
Pour lutter contre les carences en vitamine B12 parmi certaines populations d'Afrique du Sud, des aliments fonctionnels enrichis ont été développés. Cependant, les méthodes actuelles utilisées pour analyser précisément le niveau de vitamine B12 dans les aliments, qui sont importantes à des fins de contrôle-qualité et de législation, sont coûteuses en temps. Cet article décrit une méthode d'extraction et de détection de la vitamine B12 dans les produits laitiers et les cultures de Propionibacterium freudenreichii. Les échantillons étaient extraits par mélange à du tampon KCN, pH 4,5 et autoclavage à 121 °C pendant 25 min, refroidissement et centrifugation. Le surnageant résultant était filtré puis analysé par HPLC en phase inverse en utilisant un gradient méthanol-eau, qui permettait une bonne résolution du pic de vitamine B12. La méthode montrait une bonne linéarité, avec un coefficient de régression R > 0,998. La limite de quantification était de 0,005 μg*mL−1 d'échantillon. Pour des échantillons contenant des concentrations dans la moyenne de la gamme de linéarité, la répétabilité a été établie, avec des valeurs obtenues pour le même échantillon à deux jours différents de 2,62 ± 0,02 μg*mL−1 et 2,61 ± 0,02 μg*mL−1. Les rendements d'extraction variaient entre 98,6-103,2 %, ce qui indique que la méthode d'extraction permettait une dissolution complète de la vitamine B12 des matrices étudiées. La méthode HPLC était validée en comparant les résultats obtenus avec ceux de la méthode microbiologique de référence. La sensibilité de la méthode était améliorée par une série d'étapes d'extraction en phase solide pour concentrer et purifier les échantillons, ce qui améliorait la résolution des pics et éliminait les pics contaminants. La méthode décrite est une alternative rapide à la méthode microbiologique de référence.
Origine : Accord explicite pour ce dépôt
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