Toxins selective for subunit interfaces as probes of nicotinic acetylcholine receptor structure
Résumé
The pentameric structure of the nicotinic acetylcholine receptor with two of the five subunit interfaces serving as ligand binding sites offers an opportunity to distinguish features on the surfaces of the subunits and their ligand specificity characteristics. This problem has been approached through the study of assembly of subunits and binding characteristics of selective peptide toxins. The receptor, with its circular order of homologous subunits (αγαδβ), assembles in only one arrangement, and through mutagenesis, the residues governing assembly can be ascertained. Selectivity of certain toxins is sufficient to readily distinguish between sites at the αγ and αδ interfaces. By interchanging residues on the γ and δ subunits, and ascertaining how they interact with the α-subunit, determinants forming the binding sites can be delineated. The α-conotoxins, which contain two disulfide loops and 12–14 amino acids, show a 10 000-fold preference for the αγ over the αγ subunit interface with αε falling between the two. The waglerins, as 22–24 amino acid peptides with a single core disulfide loop, show a 2000-fold preference for αε over the αγ and αδ interfaces. Finally, the 6700 Da short α-neurotoxin from N. mossambica mossambica shows a 10 000-fold preference for the αγ and αδ interfaces over αε. Selective mutagenesis enables one to also distinguish α-neurotoxin binding at the αγ and αδ subunits. This information, when coupled with homology modeling of domains and site-directed residue modification, reveals important elements of receptor structure and conformation.
La structure pentamérique du récepteur nicotinique, dans laquelle deux des cinq interfaces entre sous-unités servent de sites de liaison pour l'acétylcholine, offre la possibilité de distinguer les caractéristiques des deux sites et leur spécificité pour les ligands. Nous avons abordé l'étude de l'assemblage des sous-unités par la liaison de toxines peptidiques sélectives. Le récepteur s'assemble d'une seule manière avec un ordre circulaire unique de sous-unité (αγδαβ), et il est possible d'identifier les résidus qui contrôlent ces interactions par mutagenèse dirigée. La sélectivité de certaines toxines est suffisante pour distinguer clairement les sites des interfaces αγ et αδ. En échangeant des résidus entre les sous-unités α et δ, et en analysant leurs associations avec la sous-unité α, on peut définir les déterminants des sites de liaison. Les conotoxines α formées de 12–14 acides aminés et contenant deux ponts disulfure se lient 10 000 lois mieux au site αγ, et de façon intermédiaire à αε. Les waglérines, formées de 20–24 acides aminés et possédant un seul pont disulfure se lient 2 000 fois mieux à αε qu'à αγ et αδ. Finalement, la neurotoxine α courte de 6 700 Da de Naja mossambica mossambica présente une préférence de 10 000 fois pour les interfaces αγ et αδ, par rapport à αε. La mutagenèse permet aussi de distinguer la liaison de l'α neurotoxine aux sites αγ et αδ. Ces informations, associées à la modélisation des domaines par homologie et la modification de résidus par mutagenè se dirigée, donnent d'importants éléments pour comprendre la structure et la conformation du récepteur.