LUminometric Methylation Assay (LUMA) : Mise au point et applications chez le bovin - Archive ouverte HAL Accéder directement au contenu
Poster De Conférence Année : 2017

LUminometric Methylation Assay (LUMA) : Mise au point et applications chez le bovin

Résumé

Le LUMA (LUminometric Methylation Assay) est une méthode de détection globale de la méthylation de l’ADN sur des séquences spécifiques C˅CGG (Karimi et al., 2011 ; Attig et al., 2013). Pour cela, 2 enzymes isoschizomères sont utilisés : l’enzyme MspI coupe le site C˅CGG quel que soit l’état de méthylation du CG alors que HpaII coupe sur le même site mais est inhibé s’il y a méthylation sur le CG. Une digestion par EcoRI (G˅AATTC) sert de témoin interne pour chaque échantillon digéré. Les bouts cohésifs générés par les clivages enzymatiques servent de matrice au pyroséquençage. Pour optimiser le protocole, des tests de sensibilité (quantité d’ADNg de 10 à 500 ng), ainsi que des cinétiques de clivage (de 5 minutes à 16 heures) ont été effectués. Différents points de contrôle qualité systématiques ont été mis en place comme la mesure de l’intégrité des ADN génomiques, l’utilisation d’un témoin inter-essai pour le pyroséquençage ou l’analyse de la corrélation entre le clivage par MspI et le clivage par EcoRI. Une analyse in silico nous a permis de décrire la répartition des sites C˅CGG dans le génome et d’évaluer la pertinence de l’utilisation du LUMA chez le bovin. Chez le bovin, les sites C˅CGG sont principalement localisés en intergénique mais également en intragénique (promoteur, exons et introns) et ciblent aussi des ilots CpGs. Le LUMA renseigne donc sur l’état de méthylation de régions génomiques d’intérêt. Cette technique a été appliquée pour l’analyse de la méthylation de différents tissus extra-embryonnaires bovins, à différents stades de gestation (18, 40 et 60 jours), provenant d’individus ayant le même génotype (clones) ou d’individus obtenus par insémination artificielle (IA, témoin) afin d’observer l’effet de la reprogrammation épigénétique liée au clonage. Le niveau de méthylation globale a été observé dans le lignage trophoblastique : trophoblaste à G18, chorion à G40 et G60 et cotylédons à G60. Le taux de méthylation globale augmente au cours de la gestation. Par contre, les cotylédons sont hypométhylés par rapport au chorion à G60. La méthylation globale a aussi été analysée dans d’autres tissus extra-embryonnaires bovins à G60 : amnios, allantoïde. Le taux de méthylation est significativement plus élevé dans ces tissus. Lorsque des croisements entre différentes races (Holstein X Charolais ; Bos taurus X Bos indicus) sont effectués, les taux de méthylation observés pour chaque tissu extra embryonnaire sont conservés. Enfin nous n’observons pas de grande différence entre individus obtenus par IA et les clones dans les tissus extra-embryonnaires à 60 jours de gestation. Cependant les clones décrits comme pathologiques sont hypométhylés par rapport aux clones non pathologiques. Nous montrons que le LUMA est une méthode très fiable et robuste qui permet une analyse pertinente des régions génomiques impliquées dans la régulation génique. Les tissus issus du lignage trophoblastique sont de plus en plus méthylés au cours de la gestation. Le lignage trophoblastique représenté par le trophoblaste, le chorion et les cotylédons, est néanmoins toujours hypométhylé par rapport aux autres tissus embryonnaires et extra-embryonnaires. Cela peut être associé à la nécessité d’exprimer un grand nombre de gènes en fonction des divers rôles de ces tissus (nutritif, endocrine et immunologique). Les différences du taux de méthylation observées entre IA et clones sont subtiles. Puisque l’embryon a réussi à survivre jusqu’au stade du prélèvement, cela suggère l’absence de perturbation majeure de la méthylation. Les pathologies placentaires sont certainement dues à des changements subtils qu’une quantification globale ne peut détecter. Cibler les régions spécifiques d’une dérégulation pourrait être possible en mettant en œuvre d’autres techniques d’analyse pangénomique (RRBS, Medip-Séquençage).
Fichier non déposé

Dates et versions

hal-01607588 , version 1 (03-10-2017)

Identifiants

  • HAL Id : hal-01607588 , version 1
  • PRODINRA : 396155

Citer

Audrey Prézelin, Maxime Gasselin, Jean-Philippe Perrier, Anne Gabory, Hélène Kiefer, et al.. LUminometric Methylation Assay (LUMA) : Mise au point et applications chez le bovin. 3. Journée de Séminaires du Département Phase sur l'Epigénétique EpiPhase, May 2017, Jouy-en-Josas, France. , 1 p., 2017. ⟨hal-01607588⟩
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