Use of a transient expression assay for the optimization of direct gene transfer into tobacco mesophyll protoplasts by electroporation
Résumé
Plasmid DNA was transfected into tobacco mesophyll protoplasts by electroporation. Transfection efficiency was estimated, using a transient expression assay based on the measurement of chloramphenicol transacetylase activity or by scoring colonies expressing resistance to paromomycin, an aminoglycoside related to kanamycin. Under conditions of cell survival superior to 50% after electroporation, transient expression signals and transformation efficiencies were found to be proportional.
Factors affecting the efficiency of transformation were studied. A clear-cut optimum voltage (250–300 V/cm) was detected. Among various salts tested, potassium chloride was the best electrolyte. No improvement of electroporation efficiency was obtained by a heat - shock (45°C/5 min) treatment prior to electroporation or by the presence of polyethylene glycol in the electroporation medium. The physiological state of plants used as the protoplast source significantly affected the transfection ability of the resulting protoplasts. These results are discussed and compared to previously published procedures.
De l'ADN plasmidique a été transfecté dans des protoplastes de mésophylle de tabac par électroporation. L'efficacité a été mesurée par dosage de l'activité transitoire de la chloramphénicol transacétylase ou par dénombrement des colonies cellulaires transformées exprimant une résistance à la paromomycine, aminoglycoside proche de la kanamycine. Dans des conditions de transfection où la survie cellulaire restait supérieure à 50%, les mesures d'expression transitoire et de fréquence de transformation se sont avérées proportionnelles.
Divers facteurs susceptibles d'affecter l'efficacité de transfection ont été étudiés. Les transfections se sont avérées efficaces pour des voltages compris entre 250 et 300 V/cm. Le chlorure de potassium était le meilleur électrolyte parmi divers sels testés. L’efficacité des électroporations n'a été améliorée ni en faisant subir un choc thermique à 45°C pendant 5 min aux protoplastes avant leur électroporation, ni en ajoutant du polyéthylène glycol dans la chambre d'electroporation. L'étata physiologique des plantes utilisées comme sources de protoplastes semble par contre affecter de façon importante l'efficacité de l'électroporation. Les résultats obtenus sont discutés et comparés à d'autres travaux.
