Study of the clonal heterogeneity of tumours in metastatic colorectal cancer patients by circulating DNA analysis during their therapeutic management
Etude de l’hétérogénéité clonale de tumeurs de patients atteints du cancer colorectal métastatique par l’analyse de l’ADN circulant au cours de leur prise en charge thérapeutique
Résumé
Since its discovery in 1948, circulating DNA (cirDNA) analysis has demonstrated its clinical potential in oncology.My first thesis objective was to study the clonal heterogeneity of tumors from metastatic colorectal cancer (mCRC) patients by cirDNA analysis during their therapeutic management. Only patients with non-mutant RAS tumors can benefit from anti-EGFR therapies. Prior to anti-EGFR therapy, cirDNA analysis showed the detection of higher RAS/BRAF mutations (76%, n=119) than tumor tissue analysis (55%, n=89) as well as a high proportion of co-occurring mutations (45%) in mCRC patients (KPLEX2 study). We showed that the median data turn-around time was 12 days for tumor tissue analysis (n=83; 3-273 days) versus only 2 days for cirDNA analysis (n=121; 0-10 days). These results indicated that cirDNA could replace tumor tissue analysis in clinical practice.In the retrospective KPLEXR study, longitudinal analysis of mCRC patients treated with FOLFOX-dasatinib with or without cetuximab showed that 98% of treatment-refractory patients (n=42) were RAS/BRAF mutant at the end of the treatment. This result suggested that RAS/BRAF mutations induce resistance to anti-EGFR therapy. Quantitative and longitudinal analysis of cirDNA closely mirrored variations in blood CEA levels and tumor mass as observed by CT-scan. Moreover, 21% of RAS/BRAF mutations were found with allelic frequencies lower than 0.1% revealing the need of the use of an ultrasensitive method to detect point mutations before and during anti-EGFR treatments. These results highlighted the theranostic potential of cirDNA during anti-EGFR therapy.Refractory patient tumors to all standard therapies can be treated with regorafenib. However, there is currently no biomarker to predict benefit or resistance to regorafenib. Inthe prospective TEXCAN study we observed that the RAS/BRAF mutant status of heavily pretreated mCRC patients refractory to standard therapies does not influence the survival of these patients treated with regorafenib. On the other hand, we showed that it is possible to identify prior to treatment those patients who will benefit clinically from the drug. Indeed, we were able to establish thresholds for total cirDNA concentration (26 ng/mL plasma), mutant cirDNA concentration (2 ng/mL plasma) and allelic frequency (6%) that would predict which patients will have better overall survival. The cirDNA could be a biomarker for predicting patient tumor resistance or tolerance to regorafenib.It has long been recognized that apoptosis is the most relevant mechanism of cirDNA release since many studies have shown that cirDNA has a size profile around 150-180 bp. The second objective of my thesis was to evaluate the association between NETs (neutrophil extracellular traps) formation and cirDNA production in mCRC patients. We show that a significant fraction of cirDNA in mCRC patients is derived from the NETosis mecanism. This work redefines existing paradigms on the mechanisms of cirDNA release. NET degradation and resultant cirDNA release could explain the large variation of allelic frequency in the blood of mCRC patients. However, the full set of enzymes leading to the production of cirDNA by the in vivo degradation of NETs remains to be demonstrated.
Depuis sa découverte en 1948, l’analyse de l’ADN circulant (ADNcir) a démontré son potentiel clinique en oncologie.Mon premier objectif de thèse a été d’étudier l’hétérogénéité clonale de tumeurs de patients atteints de cancer colorectal métastatique (CCRm) par l’analyse de l’ADNcir au cours de leur prise en charge thérapeutique. Seuls les patients ayant des tumeurs RAS non-mutées peuvent bénéficier des thérapies anti-EGFR. Avant traitement par anti-EGFR, l’analyse de l’ADNcir a montré la détection d’un plus grand nombre de mutations RAS/BRAF (76%, n=119) que l'analyse du tissu tumoral (55%, n=89) ainsi qu’une proportion élevée de mutations co-occurrentes (45%) chez les patients atteints de CCRm (étude KPLEX2). Nous avons montré que la médiane du délai entre la réception des échantillons et la communication des résultats était de 12 jours pour l’analyse du tissu tumoral (n=83; 3-273 jours) contre seulement de 2 jours pour l’analyse de l’ADNcir (n=121; 0-10 jours). Ces résultats indiquent que l’ADNcir pourrait remplacer l’analyse du tissu tumoral en pratique clinique.Dans l’étude rétrospective KPLEXR, l’analyse longitudinale des patients atteints de CCRm traités par FOLFOX-dasatinib avec ou sans cetuximab a montré qu’à l’arrêt des traitements 98% des patients réfractaires aux traitements (n=42) sont mutés RAS/BRAF. Ce résultat démontre que les mutations RAS/BRAF induisent des résistances au traitement par anti-EGFR. L’analyse quantitative et longitudinale de l’ADNcir mime étroitement les changements des niveaux sanguins de l’ACE et l’évolution de la masse tumorale observée par CT-scan. De plus, 21% des mutations RAS/BRAF sont retrouvées avec des fréquences alléliques inférieures à 0.1% montrant la nécessité d'utiliser une méthode ultrasensible pour détecter les mutations ponctuelles avant et durant les traitements par anti-EGFR. Ces résultats indiquent le potentiel théranostique de l’ADNcir durant un traitement par anti-EGFR.Les patients réfractaires à l’ensemble des thérapies standards peuvent être traités au regorafenib. Cependant, aujourd’hui aucun biomarqueur ne permet de prédire un bénéfice ou une résistance au regorafenib. C’est dans ce contexte qu’a été réalisé l’étude prospective TEXCAN. Nous avons montré que le statut muté RAS/BRAF des patients atteints de CCRm lourdement prétraités et réfractaires aux thérapies standards n’influe pas la survie de ces patients traités au régorafénib. Par contre, les resultats sugerent qu’il est possible d’identifier avant le traitement les patients qui auront un bénéfice clinique à cette molécule. En effet, nous avons pu établir des seuils de concentrations d’ADNcir total (26 ng/mL de plasma), d’ADNcir tumoral muté (2 ng/mL de plasma) et de fréquence allélique (6%) qui permettraient de prédire les patients qui auront une meilleure survie globale. L’ADNcir pourrait être un biomarqueur pour prédire les résistances ou les tolérances des tumeurs des patients au regorafenib.Il est admis depuis longtemps que l’apoptose est le mécanisme de libération de l’ADNcir le plus pertinent puisque de nombreuses études ont montré que l’ADNcir a un profil de taille aux alentours de 150-180 bp. Le deuxième objectif de ma thèse a été d’évaluer l’association entre la formation des NETs (neutrophil extracellular traps) et la production des ADNcir chez les patients atteints de CCRm. Nous montrons qu’une fraction importante de l’ADNcir des patients CCRm proviendrait du phénomène de NETose. Ces travaux redéfinissent les paradigmes existants sur les mécanismes de libération de l'ADNcir. La dégradation des NETs pourrait expliquer la grande amplitude de la fréquence allélique dans le sang des patients atteints de CRCm. Cependant, il reste encore à révélerer l’ensemble des acteurs conduisant à la production des ADNcir par la dégradation des Nets in vivo.
Origine : Version validée par le jury (STAR)