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n.a
N(6)-threonylcarbamoyladenosine (t(6)A) is a modified nucleotide found in all transfer RNAs (tRNAs) decoding codons starting with adenosine. Its role is to facilitate codon-anticodon pairing and to prevent frameshifting during protein synthesis. Genetic studies demonstrated that two universal proteins, Kae1/YgjD and Sua5/YrdC, are necessary for t(6)A synthesis in Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli. In Archaea and Eukarya, Kae1 is part of a conserved protein complex named kinase, endopeptidase and other proteins of small size (KEOPS), together with three proteins that have no bacterial homologues. Here, we reconstituted for the first time an in vitro system for t(6)A modification in Archaea and Eukarya, using purified KEOPS and Sua5. We demonstrated binding of tRNAs to archaeal KEOPS and detected two distinct adenosine triphosphate (ATP)-dependent steps occurring in the course of the synthesis. Our data, together with recent reconstitution of an in vitro bacterial system, indicated that t(6)A cannot be catalysed by Sua5/YrdC and Kae1/YgjD alone but requires accessory proteins that are not universal. Remarkably, we observed interdomain complementation when bacterial, archaeal and eukaryotic proteins were combined in vitro, suggesting a conserved catalytic mechanism for the biosynthesis of t(6)A in nature. These findings shed light on the reaction mechanism of t(6)A synthesis and evolution of molecular systems that promote translation fidelity in present-day cells.
Structural refinement of proteins involves the minimization of a target function that combines X-ray data with a set of restraints enforcing stereochemistry and packing. Electrostatic interactions are not ordinarily included in the target function, partly because they cannot be calculated reliably without a description of dielectric screening by solvent in the crystal. With the recent development of accurate implicit solvent models to describe this screening, the question arises as to whether a more detailed target function including electrostatic and solvation terms can yield more accurate structures or somewhat different structures of equivalent accuracy. The Generalized Born (GB) model is one such model that describes the solvent as a dielectric continuum, taking into account its heterogeneous distribution within the crystal. It is used here for X-ray refinements of three protein structures with experimental diffraction data to 2.4, 2.9 and 3.2 A, respectively. In each case, a higher resolution structure is available for comparison. The new target function includes stereochemical restraints, van der Waals, Coulomb and solvation interactions, along with the usual X-ray pseudo-energy term, which employs the likelihood estimator of Pannu and Read. Multiple simulated-annealing refinements were performed in torsion-angle space with a conventional target function and the new GB target function, yielding ensembles of refined structures. The new target function yields structures of similar accuracy, as measured by the free R factor, map/model correlations and deviations from the high-resolution structures. About 10% of side-chain conformations differ between the two sets of refinements, in the sense that the two ensembles of conformations do not completely overlap. Over 75% of the differences correspond to surface side chains. For one of the proteins, the GB set has a greater dispersion, indicating that for this case the conventional target function overestimates the true precision. As GB parameterization continues to improve, we expect that this approach will become increasingly useful.
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